刑事案例诉辩审评--强奸罪拐卖妇女儿童罪/刑法分则实务丛书 在线下载 pdf mobi 2025 epub 电子版

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• 作者：J 发布时间：2020-07-25 05:08:59

  系统地介绍了学科的大致框架，具备基本的微积分知识很容易看明白，是优秀的入门书籍。

• 作者：杜子 发布时间：2020-09-01 10:22:03

  前三分之一的写作手法确实ok，花了心思，然后把控制欲、受害者/失害者写得挺好。值得几小时看看。

• 作者：选毫圆健 发布时间：2023-11-11 08:30:54

  学习用词典（一般而言足可应付八到九成的查询需求）

  ↓

  所收词是语言的核心部分，以现代常用词为主；释义先列常见的释义，次列不常见的释义；这中说明词的用法，详析注明搭配

  ↓

  LONGMAN Dictionary of Contemporary English------释义模糊，例句地道

  Oxford Advanced Learner's Dictionary-------------------释义清楚，例证生涩

  参考用词典（这类型的辞典在应付较不常见的单词）

  ↓

  收词以现代为主，力求全面，包括通用的、专科的，以及百科知识的词；义项先列词的中心意义，次列边缘意义，注明词源

  ↓

  Oxford English Dictionary of English------------英国版“现代汉语

• 作者：不知道叫啥名 发布时间：2020-03-16 17:47:54

  道理我都懂，鸡汤我都知道，但其实没有什么实际作用，都是空话大话，问题是我们也做不到。不过，这个问题确实值得思考。

• 作者：GUPAI 发布时间：2017-07-01 16:47:15

  喜欢哈维和蝙蝠侠教育杀死孩子猫的爹的故事

• 作者：Eleven. 发布时间：2023-03-15 15:35:53

  诶嘿，隔空感谢黎老师！找到了三个有趣的可讨论案例！

• 等待，在希望之中..............

  作者：晴耕雨读 发布时间：2012-01-17 12:39:58

       这是一个没人能不被它吸引的故事。

  　　　　　　

  　　浩淼无边的地中海，怪兽一样阴森的古堡监牢，埋藏着无数财宝和秘密的孤岛，天边的一点白帆…… 共同把无数人领进这幅诡奇而瑰丽的长长画卷。从坟墓中苏醒过来的复仇者，带领着我们，走进那个十九世纪的《一千零一夜》世界。我们和他一同走过静谧安详的西班牙小渔村，光怪陆离的罗马狂欢节，黄沙漫漫的北非，烽火连天的希腊，灯红酒绿的巴黎……我们和他一同经历一切：蒙冤，越狱，发掘宝藏，浪迹天涯，报恩，复仇，追寻已经失去的爱情和青春……

  　　　　　　

  　　我们和他一同被囚禁在暗无天日的死牢，渡过了漫长的十四年；我们和他一同被装进运尸袋，从万丈峭壁上跌下，投入无边的大海；我们和他一同躺在礁石上，渡过了那个无星也无月的暴风雨之夜，在暮色与海水之间拼命地呼喊、求救；我们和他一同在那个神秘孤岛最深的洞穴里，用颤抖的手，抹去额头上滚烫的汗水，捧起无数熠熠生辉的金币与珠宝。

  　　　　　　

  　　这个离奇的故事，在作家那枝生花的妙笔下，竟显得如此真实，以至于每年都有无数游客从全世界的各个角落来到法国，寻找和这个故事相关的一切；而当地的居民，也会殷切地为游客们提供所有线索。

  　　　　　　

  　　当你来到马赛时，有人会领你去看卡塔卢尼亚姑娘的海边小屋、守望在海边的那块礁石；

  　　　　　　

  　　当你去伊夫堡参观时，有人会把你带到神甫坐过的黑牢，向你兜售他制作的鱼骨笔尖；

  　　　　　　

  　　当你乘船路过那个小岛时，有人会指着欧石南丛中的某处阴影，告诉你，那就是宝藏埋藏的地方；

  　　　　　　

  　　而当你来到巴黎，不用人指引，你自己就会找到书中的一切：塞纳河，香榭丽舍大街，残老军人院，拉雪兹神父公墓；

  　　　　　　

  　……

  　　　　　　

  　都知道这个故事了吧？

  　　　　　　

  　《基督山伯爵》。

  　　　　

  一、

  　　　　　　

  　　从天堂到地狱，从云端到深渊，只有一个夜晚的距离。

  　　　　　　

  　　他曾是个天真而单纯的贫苦水手。他曾前途无量，在自己二十几岁的时候便要成为船长；他曾经无比幸福，即将和一个美丽善良的姑娘成婚。他的生活简单而温馨，三分之一属于大海，三分之一属于老父亲在马赛的公寓，另外三分之一，则属于卡塔卢尼亚姑娘的那间海边小屋。

  　　　　　　

  　　那时的埃德蒙•唐泰斯，不大会想到今后会有什么在等待着自己，也许他会对自己的未来有着憧憬，但这憧憬肯定不会真切，对沉浸在幸福中的人来说，保持现状，无疑就是最大的幸福。

  　　　　　　

  　　他还需要什么呢？他有整个天空，他有整个大海，他有带着咸腥味的海风，他有灿烂的阳光，他还有慈祥的老父亲，美丽的新娘。他还用再去憧憬和渴望什么吗？

  　　　　　　

  　　如果没有任何意外，他本来应该成为一个人人敬佩的年轻船长，一个幸福的丈夫，他本应过着摩雷尔船主的女儿女婿那样的生活，清贫，然而快乐，安详。

  　　　　　　

  　　可惜，没有那么多如果，婚宴上宪兵队长的第一声敲门，如敲响他一生的丧钟那样，使一切都成为了定局。所有的幸福在触手可得之际，刹那间灰飞烟灭。在那个凄惨的夜晚，当埃德蒙在宪兵们的押送下路过梅尔塞苔丝那间小屋的门口时，他能否想到，窗口那点摇曳的灯火，竟是她留给自己的最后回忆？当这对苦命的恋人再度找回这回忆时，已是二十余年后。一个已为人母；另一个，虽依旧孑然一身，却早已冷酷到底。

  　　　　　　

  　　此情可待成追忆，只是当时已惘然。

  　　　　　　

  　　伊夫堡，这座盘踞在海上的狰狞监狱，这座多少年来为马赛增添了无数悲惨传说的古堡，在他面前缓缓开启了大门，像怪兽慢慢张开巨口一样将他吞噬。短短几天中，他被出卖，被逮捕，被秘密宣判，现在则被投入坟墓。从此，他的生命中便再也没有过绚丽的天空，再也没有轮廓优美的渔船，再也没有炽热的光芒；萦绕在身边的，只有黑暗和绝望。

  　　　　　　

  　　我一直觉得，监狱的大门口，应当镌刻上地狱之门的那句箴言：“进到这里的人，把希望留在门外。”

  　　　　　　

  　　伊夫堡十四年的铁窗生涯，开始了。

  　　　　

  二、

  　　　　　　

  　　在那所黑暗、潮湿而逼仄的地牢中，埃德蒙想到了自己所能想到的一切。他幻想检察官会良心发现，把自己从狱中拯救出来；他幻想典狱长会大发慈悲，得知冤情后便能重新赐给自己自由；他在祈祷中幻想神迹的出现，他向上帝哀哭自己的冤屈，忏悔自己从前无心犯下的一切微不足道的过错。他在等待，日复一日地等待，希望却通通落空，检察官把无辜者弃之不顾，典狱长和狱卒们对囚犯的恳求和哀哭充耳不闻，上帝漠视这虔诚信徒的祈祷。一切希望破灭后，他终于想到了死。

  　　　　　　

  　　这是最好的解脱么？对当时的他来讲，无疑是的，绝处逢生的奇迹却偏偏在此刻出现。这不是上帝的慈悲，这是大仲马送来的救世主。满身泥土的法里亚神甫从地道中爬进来，出现在他的牢房里，像《出埃及记》里的摩西一样，肩负起拯救他的使命。每次读到三十四号和二十七号狱中偷偷来往的那一段，都能感到一种淡淡的温馨从书页中弥散开来，一直流淌进自己的心田。这个暗无天日的狭小空间，随着神甫的到来，监牢中第一次有了一缕光明，仿佛黑暗中点燃的火柴，微弱却弥足珍贵。神甫为他带来人与人的交流，带来生活的勇气，带来足以使他凌驾于芸芸众生之上的智慧与学识，带来那笔数额难以想象的巨大财富，甚至最后还以自己的死亡，给他带来了自由。而最重要的是，给他带来了希望。

  　　　　　　

  　“谢谢，我的父亲，谢谢！”

  　　　　　　

  　　二十四年后，重游伊夫堡时，基督山伯爵面对着神甫最后遗留下的手稿，无比虔诚地单膝跪下，满怀深情地喊出了这句话。每次读到这里，我都不禁掩卷太息：面对着赋予了自己第二次生命的老人，还有什么比这一声“我的父亲”更能表达出自己的感激？

  　　　　　　

  　　活下去，要重获自由，要报恩和复仇，为了法里亚。这是神甫病故后，支撑着埃德蒙的唯一愿望。于是他钻进本来是为神甫准备的运尸袋；于是他被当作神甫的尸体，被掘墓人丢进大海；于是他在那个暴风雨之夜，只身在茫茫大海中挣扎；于是他死里逃生，找到宝藏，成为了呼风唤雨，无所不能的基督山伯爵。

  　　　　　　

  　　生与死，在那一夜的风雨中模糊了边界。水手埃德蒙死去了，活下来的，是基督山伯爵。

  　　　　

  三、

  　　　　　　

  　　老父亲已经饿死，恋人已嫁给自己的情敌，自己的仇人们却靠着欺诈、背叛，一个个平步青云，飞扬跋扈。他面前还有漫长的路要走。

  　　　　　　

  　　于是，我看着他来到基督山岛，发掘出宝藏；我看着他来到马赛，挽救了有恩于他的船主；我看着他来到罗马，结识了仇人的儿子；我看着他来到巴黎，开始了筹划已久的复仇。我看着他用一张张面具掩盖自己的真实身份：水手辛巴达，布佐尼神甫，威尔莫爵士……我看着这位复仇天使，像从坟墓中爬出的吸血鬼那样重返人间，在黑暗的天幕下，张开不祥的翅膀，举起审判者的利剑，在舞台上布下一个个精致而致命的陷阱，自己却隐藏在幕后的阴影中，带着梅菲斯特一样愤世嫉俗的笑容，等待着猎物们的到来。

  　　　　　　

  　　一个个与自己的复仇相干或不相干的人，先后在这支手的摆布与指引下，一步步来到舞台，上演一出出阴森森、血淋淋的活剧，最后相继毁灭在这张罗网中。费尔南作过叛徒，唐格拉尔靠投机发财，维勒福在庄严的法官长袍下埋藏着无数罪恶，于是背叛者身败名裂，投机者倾家荡产，审判者被推到审判台前。三个恶人都曾以种种卑鄙的手段得到了荣誉、财富、地位；而现在，他们的仇人则以更冷酷凶狠的手段，重新将这些一一剥夺，只给他们和他们的家庭留下更大的痛苦，借着上帝的名义。

  　　　　　　

  　“听着，如果有人用闻所未闻的折磨和无穷无尽的痛苦，夺走你的父亲、母亲、情人，总之，夺走一个一旦从你的心中连根拔去，就会留下永恒的空缺和永远血淋淋的伤口的人，而社会给你的补偿，只是用断头机的刀刃在凶手的枕骨底部和斜方肌之间砍过去，让那个使你忍受多年精神痛苦的人只受几秒钟的肉体疼痛，你认为这种补偿够不够？”

  　　　　　　

  　　二十四年间，就是这样的信念，支撑着他的全部生活。这是怎样冷酷的铁石心肠？这是怎样炽热的仇恨之火？

  　　　　　

  　　当他在摇曳的烛光下，在临终的卡德鲁斯耳边，轻声说出自己真正的名字时；

  　　　　　　

  　　当他重新换上水手服，目光中露出无穷的凶狠残酷，出现在莫尔塞夫面前时；

  　　　　　　

  　　当他来到维勒福的公馆，向精神濒临崩溃的检察官宣读自己开具的判决书时；

  　　　　　　

  　　当他现身于洞窟中，面对着饿得奄奄一息的唐格拉尔，摘下基督山的面具时；……

  　　　　　　

  　　积攒了二十四年的仇恨，钢铁一样坚强的意志，取之不尽用之不竭的金钱，对世事无比冷静而精准的洞察和把握……这一切，在那些时刻，不可思议地同时集中在他身上。复仇，这个同爱情、战争和死亡一样古老而永恒的主题，从古至今曾经被多少人以各种形式演绎过，然而谁也没能像基督山或不如说是大仲马那样，把它真正变为一种艺术，大海一样波澜壮阔，史诗一样荡气回肠，油画一样浓墨重彩，暴风雨一样震撼人心。

  　　　　　　

  　　可是为什么？为什么他在一次次成功后，感觉不到胜利的喜悦？为什么他的目光仍然充满忧郁？

  　　　　

  四、

  　　　　　　

  　最终，不敢面对的终将面对。

  　　　　　　

  　 与阿尔贝决斗前夜，面对着梅尔塞苔丝的泪水与哀求，他冷酷依旧：“你感受过你父亲在你离开后死去的痛苦吗？你见过你所爱的女人向你的情敌伸出手去，而你在深渊奄奄一息吗？……”

  　　　　　　

  　“没有，但我看到了我一直爱着的人，准备变成杀我儿子的凶手！”梅尔塞苔丝泪如雨下。

  　　　　　　

  　　还有什么语言，能比这句话饱含着更多的痛苦与绝望？

  　　　　　　

  　　那颗大理石般冷酷坚硬的心上，终于留下了一道划痕。基督山从喉咙中发出一声呜咽，第一次，他对自己的复仇动摇了，而紧随其后的小爱德华的死，第二次让他明白，自己已超过了复仇的权限，他明白他再也不能说：“上帝支持我，与我同在。”

  　　　　　　

  　　自己错了么？他不愿相信。然而马赛的老房前，再度面对梅尔塞苔丝时，他仍空前的迷惘。二十四年后，这对曾经的恋人终于能以昔日的身份，重逢在他们曾热恋过的地方，只可惜物虽是，人却非。基督山自不必说，即使是梅尔塞苔丝，按她自己的话说，也只活在两座坟墓之间，一座属于原来的埃德蒙；另一座属于她现在的丈夫。后者曾把前者投进第一座坟墓；而现在，前者又把后者投进第二座坟墓。

  　　　　　　

  　面对着昔日的恋人，毫无疑问，基督山是自私的。他自己从坟墓中生还，从一文不名的水手变为富可敌国的伯爵，从单纯善良的埃德蒙变为冷酷无情的基督山，他的恩人得到了报答，他的仇人得到了惩罚，上帝的交给了上帝，撒旦的还给了撒旦。然而梅尔塞苔丝呢，她的丈夫羞愤自杀；她的独子因父亲的耻辱而改变姓氏去参军，生死未卜；她自己也抛弃了所有财产，进了修道院，这些都是拜基督山的复仇所赐，而她又何其无辜？为什么本来只属于她丈夫一个人的罪责，也要她跟着一同承担？

  　　　　　　

  　二十四年前，离伊夫堡外一百法里的那个小渔村中，还是个少女的她，日复一日地伫立在礁石上，忍受着孤独和恐惧的煎熬，等待自己心上人的归来，望眼欲穿；二十四年后，她已韶华不再，却仍然要继续守候在海边，眺望着天边的地平线，等待自己儿子的归来。她为自己的情人哀哭和等待了二十四年，而今，又要为自己的儿子继续哀哭和等待下去，终其一生，她都将如此度过——命运，或者说基督山，为何待她如此不公？

  　　　　　　

  　耐人寻味的是，梅尔塞苔丝却并未对基督山的复仇有任何微词，尽管她最有资格质疑这复仇的合理性。一切都被归咎于自己的胆怯与懦弱，她最终看破红尘，皈依宗教，准备在祈祷中了却残生。这或许可以算是对基督山另一种意义上的宽恕；而我更愿相信，梅尔塞苔丝做出这个决定时，一半是为了自己的儿子，另一半却是为了基督山。她明白他的心已在黑暗中浸淫太久，太需要一缕光明了。她真的胆怯和懦弱么？恰恰相反，她何其勇敢，何其坚强。梅尔塞苔丝之于基督山，正如《神曲》中的贝雅特丽丝之于但丁，两人同为那暗夜中独行的游者，点燃一盏照亮前途的明灯。

  　　　　　　

  　面对着这种献祭般的自我牺牲，基督山，一向以上帝的使者自居的基督山，终于在达到复仇的顶峰后，从高山的另一边看到了怀疑的深渊。

  　　　　　　

  　“什么，我确定的目标会是一个疯狂的目标！什么，十年来我走错了路！什么，一个小时就足以向建筑师证明，寄托着他全部希望的事业，如果不是实现不了，至少也是渎神的事业！”

  　　　　　　

  　　大功告成之后，没有喜出望外，没有如释重负，只有郁郁寡欢。

  　　　　

  五、

  　　　　　　

  　　当基督山重游伊夫堡时，眼前的一切都在唤醒那酸楚的回忆，黑牢中，与当年相关的所有痕迹触目皆是：这里是肩膀在墙壁上留下的印迹，那里是额头在石头上撞破留下的血迹，自己与神甫的故事也被狱卒和门房们当作久远的传说，讲给一个个游客……虽然走出古堡后，他仍信誓旦旦地宣称，要让那些把自己关进监狱的人倒霉，让那些忘记自己关在里面的人倒霉，但最终却自食其言，他到底还是放过了陷害自己的主谋唐格拉尔——毕竟，他自己也同样需要被宽恕。

  　　　　　　

  　　此时基督山所做的一切，其实已与仇恨无关，仅仅是为了给自己十年来殚精竭虑、惨淡经营的计划，划上一个完整句号。

  　　　　　　

  　　宁静安详的海面上，明媚晴朗的天空下，一点白帆消失在海天之间，远离了尘世所有的恩怨情仇。它带走了基督山，也带走了他前半生幽暗而神秘的传奇，这是这个故事的结束，却也是他新生的开始，从这时起，这个曾自认为能与上帝匹敌的撒旦，终于垂下了自己倨傲的头颅，安之若素地沐浴在光明之下，他与这个世界和解了。幸福，这个他本以为再也与自己无关的词，阔别了二十四年之后，终于回到了身边。对基督山来说，幸福不是腰缠万贯，不是他拥有的呼风唤雨的强大力量，更不是复仇的成功，甚至也不是最后得到的希腊公主的爱情，而是心灵超然的平静，是重重磨难过后，对人生一如既往的热爱。诚如他留给马克西米利安的信中所言，世界上没有幸福和不幸，有的只是境况的比较，唯有经历过苦难的人才能感受无上的幸福，必须曾经想过死去，才会明白生是多么欢乐。

  　　　　　　

  　“人类的全部智慧就包含在这两个词中：等待和希望！”

  　　　　　　

  　这句小说中最著名也最广为流传的名言，曾被人断章取义，以此为依据批评作者宣扬消极人生观和唯心主义，我的看法则刚好相反，它恰恰体现出大仲马一如既往的积极进取的人生态度，也与整部小说的主旨遥相呼应，堪称画龙点睛的一笔。等待，不是听天由命，不是随波逐流，不是自暴自弃，不是得过且过，而是以平和的心境面对世事无常、造化弄人，真正的光明不是永远没有黑暗，只是不会被黑暗所遮盖；而希望，更毋庸赘言，生于死，胜与败，往往只在这一线之间，只取决于自己心中那团希望之火能燃烧多久。当还是个囚徒的埃德蒙无数次陷入绝望试图自杀时，正是希望使他活了下来；当他沉浸在神甫病逝的悲痛中不能自拔时，正是希望使他重获自由；当他在复仇中迷失了自我，满心何去何从的迷惘时，还是希望使他，也使梅尔赛苔丝，重新找回人生的方向。

  　　　　　　

  　面对着挫折与磨难，消沉还是奋进，放弃还是坚持，to be or not to be，答案都在“等待”、“希望”这两个词中。

  　　　　　　

  　　我望着天边渐渐消失的那一点白帆，恍惚间又回到二十四年前，那是整个故事的开头。普罗旺斯的阳光如此明朗，带着浓郁咸腥味的海风扑面而来，汽笛声在海浪的呼啸、岸边的人声鼎沸中如此清晰，我看到那个容光焕发的十九岁年轻人，面容坚毅而镇定，引领身后的法老号缓缓驶进马赛港。他将在这次航行结束后被任命为船长，也将迎娶与自己相恋了多年的卡塔卢尼亚姑娘。

  　　　　　　

  　　那时，还是埃德蒙的基督山就说过，幸福就像那些魔岛上的宫殿，由巨龙把守着门口，必须斗争才能得到幸福。而二十四年后，还有谁，能比他对自己这句话有着更深的体验？

  　　　　

  六、

  　　　　　　

  　行文至此，似乎本可以结束，但还是要再添上一笔蛇足。

  　　　　　　

  　　二百年来，大仲马和他的这个孩子在主流文学界得到的评价始终不高。毕竟，在这样一部以情节曲折离奇见长的通俗小说中，你很难发掘出太多深刻的现实意义或哲学道理，它带给我们的，首先是阅读快感，其次还是阅读快感。但谁能以此为理由指责它呢？我曾多少次诚惶诚恐地打开托尔斯泰、陀斯妥耶夫斯基的煌煌巨著，然而总是一次次丧失读下去的勇气，而随意翻到这部小说的任何一页，却都能着魔一样地沉浸在基督山的历险中不能自拔。屈指算来，从第一次读《基督山伯爵》到现在，已经过了整整十二年，我已记不清十二年间多少次重读这部小说，以至于自己甚至能将书中不少精彩对话一字不差地背下来。或许在有人看来，迷恋这样一部十九世纪的法国武侠小说，多少显得没有品味，但我仍要说，这是我最喜欢的小说，我甚至拒绝在这句话后面加上“之一”这个词。就像人们对鲍鱼鱼翅等山珍海味趋之若鹜时，我却仍固执地留恋着老北京的炒肝、卤煮一样。

  　　　　　　

  　原因无它，正如《仙剑奇侠传》是无数游戏迷的初恋、《圣斗士》是无数动漫迷的初恋一样，《基督山伯爵》，也是我这个小说迷的初恋。

  　　　　　　

  　　在自己的诞辰200周年，2002年，大仲马的骨灰终于被移到先贤祠，与他的老朋友维克多•雨果相伴，早就在那里等待他的其他四位文豪，分别是卢梭、伏尔泰、左拉和安德烈・马尔罗。当时的法国总统希拉克在仪式上讲话时说：“跟大仲马一起被珍藏进先贤祠的，还有童年时候美好的阅读时光，激情和浪漫。”

  　　　　　　

  　　听到这句话，我忽然忍不住潸然泪下.

• 《CRISPR基因编辑技术》书钞之一

  作者：Cheshire cat 发布时间：2022-10-24 17:25:04

  CRISPR-Cas

  基因座由一系列编码

  Cas

  蛋白的基因和一个

  CRISPR

  重复间隔序列组成[

  9

  ]。典型的

  CRISPR

  重复间隔序列由一段前导序列、一系列短的高度保守的正向重复序列和间隔序列依序排列组成[

  10

  ]

  。

  与传统的核酸酶介导的

  DNA

  编辑技术锌指核酸酶（

  ZFN

  ）和类转录激活因子效应物核酸酶（

  TALEN

  ）不同，

  CRISPR-Cas9

  系统对

  DNA

  识别的特异性不是由蛋白质决定[

  24

  ]，而是由

  20nt

  向导

  RNA

  决定[

  25

  ]。因此无需对核酸酶上的

  DNA

  识别结构域进行繁琐的蛋白质工程改造[

  26

  ]，从而极大地扩展了

  CRISPR-Cas9

  在大规模基因组操作或筛选中的应用以及在科学界的适用性。

  ATP

  依赖的解旋酶活性存在的情况下，

  PAM

  识别如何触发诱导

  R

  环形成。

  在

  PAM

  识别并随后形成

  RNA-DNA

  异源双链体后，

  Cas9

  酶被激活以进行

  DNA

  切割[

  30

  ]。

  Cas9

  使用两个核酸酶结构域行使功能，一个是三段分开的

  RuvC

  基序组成的保守

  RuvC

  结构域，另一个是位于蛋白质中间的

  HNH

  结构域。每个结构域都在距

  NGG PAM

  序列

  3bp

  的特定位点切割靶

  dsDNA

  的一条链，以产生末端为平末端的

  DSB

  [

  18,20

  ]。但是，

  Cas9

  切口酶（对于

  SpCas9

  为

  D10A

  或

  H840A

  ）只能切割

  DNA

  双链体的一条链，从而导致单链断裂[

  20

  ]。

  Cas9

  切割包含

  PAM

  片段和

  20nt

  靶链，但不包含非靶链的部分双链体时，其速率与切割完全配对的靶

  dsDNA

  几乎没有区别[

  30

  ]。

  在这种模型中，向导

  RNA

  的结合触发了

  Cas9

  的构象重排[

  29,36

  ]，这将

  Cas9

  酶从非活性状态转变为具有

  DNA

  识别能力的构象[

  36

  ]。

  RNA

  种子序列以

  A

  型构象进行预排序以结合靶标链，并预定位了

  PAM

  识别位点以进行

  PAM

  检测[

  36

  ]。

  Cas9

  与

  PAM

  序列的初始结合使酶可以快速“询问”邻近的

  DNA

  ，用于识别潜在的靶序列[

  30

  ]。一旦

  Cas9

  找到含有适当

  PAM

  的潜在靶标，它将启动双链解链并继续对靶序列进行检测[

  30,44,59

  ]。磷酸酯锁环可稳定解链后的靶

  DNA

  链，使靶

  DNA

  序列的第一个碱基朝向导

  RNA

  翻转并向上旋转以进行碱基配对[

  37,46

  ]，而

  Cas9

  与非靶链上的翻转碱基相互作用则有助于双链解旋[

  37,58

  ]。

  Cas9

  的向导

  RNA-

  靶碱基配对和相应的构象变化有助于引导

  RNA

  链侵入种子区域之外[

  31

  ]。非种子区域依次从约束中释放[

  37

  ]，碱基配对传播到引导序列的

  5′

  末端[

  30,44

  ]。这种渐进式碱基配对在

  Cas9

  内诱导进一步协调一致的构象变化，直到达到有活性状态[

  54,57

  ]。最终，向导

  RNA

  和靶

  DNA

  的完全退火可使

  HNH

  达到稳定、有活性的构象，以切割靶链[

  37,58

  ]。

  HNH

  构象变化的同时，其两端的铰链区也发生构象变化，进而将非靶链引导至

  RuvC

  催化中心，以实现协同一致的切割[

  37,56

  ]。切割后，

  Cas9

  仍与切割的靶

  DNA

  紧密结合，直到其他细胞因子取代酶以进行重复使用[

  30

  ]。

  根据

  CRISPR-Cas

  基因位点结构和

  Cas9

  系统发育，

  Ⅱ

  型

  CRISPR

  系统进一步分为

  Ⅱ-A

  、

  Ⅱ-B

  和

  Ⅱ-C

  三种亚型[

  61

  ]。迄今为止，

  CRISPR-Cas9

  系统几个亚型的代表性成员已被成功用于真核生物中的基因组编辑。其中，化脓性链球菌的

  Ⅱ-A

  亚型

  Cas9

  （

  1368

  个氨基酸）是基因组工程研究最常用的

  Cas9

  版本，而金黄色葡萄球菌的

  Cas9

  直系同源物（

  SaCas9

  ，

  Ⅱ-A

  亚型）[

  62

  ]和脑膜炎奈瑟氏球菌

  Cas9

  （

  NmeCas9

  ，

  Ⅱ-C

  亚型）[

  63

  ]，由于其较小的长度（

  <1100

  个氨基酸），具有容易被

  AAV

  病毒包装后向体细胞组织进行基因递送的潜在优势。相反，来自新凶手弗朗西斯菌的

  Ⅱ-B Cas9

  亚型（

  FnCas9

  ）由

  1629

  个氨基酸组成，明显大于来自

  Ⅱ-A

  和

  Ⅱ-C

  亚型的其他

  Cas9

  直系同源物[

  60

  ]。除了不同的长度和序列外，

  Cas9

  直系同源物能识别不同的

  tracrRNA

  ：

  crRNA

  双链体的

  PAM

  序列[

  60

  ]。例如，

  SpCas9

  识别紧邻靶

  DNA 3′

  末端的

  5′-NGG-3′PAM

  序列，具有特定的切割活性，而

  SaCas9

  识别

  5′-NNGRRT-3′PAM

  ［其中

  R

  代表一个嘌呤（即

  A

  或

  G

  ）］[

  62

  ]，

  FnCas9

  特异性检测靶

  DNA

  下游的

  5′-NGG-3′PAM

  基序[

  64

  ]

  在不直接改变

  DNA

  序列的情况下操纵转录和基因表达是染色质生物学领域长久以来的目标。

  与一般的基因组编辑不同，表观基因组编辑中脱靶效应的缓解不仅与

  dCas9

  在特定基因位点的

  DNA

  结合活性有关，而且与修饰标记在特定核小体上的时空精度相关。

  表观基因组编辑实验中抗体特异性不足的其他局限性可能会随着工业界和学术界之间越来越多的合作关系而变得不那么突出，这有助于激发大家对于开发高特异性抗体的共同兴趣。学术界应该团结一致地行使其商业权力，并要求工业界改进标准化的操作和提升内部质量控制，以最大限度地减少商业抗体供应（尤其是多克隆供应商）中常见的批次间差异。鉴于使用可靠和足够的抗体对于促进研究人员的研究结果可重复性具有重大意义，因此，科研群体必须利用资源开放的方式来展示和验证表观遗传实验中的抗体性能，例如开放抗体验证数据库和抗体特异性数据库[

  36,55

  ]。组蛋白乙酰基转移酶和其他表观遗传效应子有限的底物特异性对有效和可编程的

  CRISPR

  介导的表观基因组编辑的发展造成了巨大的障碍。为了降低某些表观遗传效应子之间底物混乱性和提高同源靶标蛋白的选择性，可能需要详细的结构信息和繁琐的蛋白质工程改造。表观基因组的读码因子、编码因子和擦除因子的结构特征（包括单个蛋白以及它们形成的复合物）对于指导旨在开发化学探针以调节表观遗传调控子的工作也至关重要。

  锌指核酸酶和

  TALEN

  等较旧的技术已被证明仍然是具有价值的，并且可以继续用作表观基因组编辑工具[

  24,137

  ]